达安基因招股说明书

求达安基因丙型肝炎病毒RNA试剂盒的说明书的试验步骤

【检验方法】

1实验前准备

1.1每瓶蛋白酶K（干粉）中各加入1.375ml的洗脱液，充分混匀，溶解。-20℃保存。

1.2每管CarrierRNA（干粉）中各加入110μl的HCV内标溶液，充分混匀，溶解。-20℃保存（CarrierRNA为白色或半透明物质，请仔细检查，确保其完全

溶解）。

1.3抑制物去除液（浓缩液）中加入10ml的无水乙醇，并在瓶盖及瓶身上打勾。室温保存。

1.4每瓶去离子液（浓缩液）中各加入44ml的无水乙醇，并在瓶盖及瓶身上打勾。室温保存。

1.5进行实验前须将病毒裂解液与CarrierRNA进行混合（现配现用），配置成裂解工作液。其比例见下表：

1人份24人份48人份

病毒裂解液200μl4.8ml9.6ml

CarrierRNA4μl96μl192μl

注：如将病毒裂解液、抑制物去除液不恰当地放置在低温时，可能会出现结晶沉淀。37℃温育至其消失即可；

各试剂使用完后，请旋紧瓶盖。

2核酸提取（样本制备区）

将待测样本与阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品进行同步处理。

2.1在1.5ml的无菌离心管内加入50μl的蛋白酶K；

2.2取样本200μl加入离心管中；

2.3再加入200μl的裂解工作液（即已含CarrierRNA的病毒裂解液），盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，高速离心10秒（防止温育时产生气泡），72℃

10分钟。同时可将洗脱液置于72℃预热；

2.4再加入250μl无水乙醇，盖紧管盖，振荡15秒；

2.5将混合液全部吸至离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管；

2.6将500μl的抑制物去除液加入离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管；

2.7将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管；

2.8再次将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管；

2.9将离心柱-收集管于室温下14,000rpm离心3分钟以除去残余的乙醇；

2.10将离心柱取出，放置于新的1.5ml离心管。打开离心柱盖子，72℃放置2分钟（使用干式恒温器，不能使用水浴锅）；

2.11在离心柱的膜的正上方小心加入72℃预热的洗脱液35μl，盖紧离心柱管盖,室温静置1分钟后，14,000rpm离心1分钟。离心管内即为病毒核酸溶液，建

议立即使用，如需保存，置于-20℃。

3PCR试剂准备（试剂准备区）

大包装规格试剂适用：

从试剂盒中取出HCV反应液A、HCV反应液B、HCV反应液C，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。

取N个（N＝待测样本个数+阴性质控品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+4管HCV阳性定量参考品）PCR反应管，

HCV单人份扩增体系配制如下表：

组分HCV反应液AHCV反应液BHCV反应液C总体积

用量2μl3μl25μl30μl

将各组分充分混合，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30μl扩增体系分装到PCR管中。

单管单人份规格试剂适用：

直接使用HCV-PCR反应管。

4加样（样本制备区）

往上述HCV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HCV阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品和直接加入HCV阳性定量参

考品20μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。